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細(xì)胞介紹

一個(gè)胰腺癌病人的腹水中的細(xì)胞移植到裸鼠后建立了這個(gè)細(xì)胞株。

注：本培養(yǎng)基是不直接添加吉西他濱藥物的。如果客戶需要直接添加的我們可以按照客戶的意愿添加吉西他濱藥物。

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：ASPC-1耐藥篩選

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1×10^6  細(xì)胞數(shù)             

4） 用途：僅供科研使用

細(xì)胞運(yùn)輸、保存及注意事項(xiàng)

細(xì)胞耐藥誘導(dǎo)過(guò)程

待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，開(kāi)始倍增藥物誘導(dǎo)劑量，每個(gè)劑量保持至細(xì)胞可以穩(wěn)定生長(zhǎng)至匯合度達(dá)50%以上。遞增藥物濃度依次為：0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。約10個(gè)月后，細(xì)胞可在18μg/mL GEM藥物濃度下穩(wěn)定生長(zhǎng)，視為耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功，并命名為ASPC-1/GEM。

細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制

1）GEM藥物的配制及保存

建議將GEM藥物配制成18mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM藥物，使其完全溶解。

注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效。溶解后的GEM，4℃保存1周，-20℃保存1個(gè)月，-80℃保存6個(gè)月。

2）凍存液的配制

90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3）完全培養(yǎng)基的配制（推薦使用iCell-h005-001b）

細(xì)胞培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%；溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。

細(xì)胞處理

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2~3day換液。

注意：①細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)完全展開(kāi)，生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加GEM藥物。若加藥后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的GEM濃度；

②建議復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)始終穿戴防護(hù)手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸，造成人員傷害。

2）細(xì)胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入適當(dāng)體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞全部脫落。迅速拿回操作臺(tái)，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。 

④將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細(xì)胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕吹混勻。將細(xì)胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個(gè)新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2~3day換液。

注意：細(xì)胞傳代過(guò)程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)完全展開(kāi)，生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加GEM藥物。若加藥后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的GEM濃度。

3）細(xì)胞凍存

①細(xì)胞凍存時(shí)，步驟同2）細(xì)胞傳代的①~④，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入配制好的細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞，按照1×10^6 ~ 1×107個(gè)細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

②將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。