貨號(hào)：iCell-MD01-001
支原體污染 PCR 檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染，也可作為支原體通用檢測(cè)試劑盒 使用，可檢測(cè)屬于柔膜菌綱(Mollicutes)的支原體（Mycoplasma）、脲原體（Ureaplasma）、無(wú)膽甾原體 （Acholeplasma）、螺原體（Spiroplasma）、蟲原體（Entomoplasma）、中間原體（Mesoplasma）等超過一 百種，但不適用于檢測(cè)嗜血支原體，與柔膜菌綱以外的其他生物沒有特異性反應(yīng)。
支原體，也有稱為霉形體、霉?jié){菌或微漿菌，是一種直徑約為 0.1-0.3 μm、無(wú)細(xì)胞壁的原核生物，屬 于柔膜菌綱(Mollicutes)，常被用作柔膜菌綱的統(tǒng)稱。具有變形能力，可透過常見過濾膜（0.22-0.45 μm）， 因此常規(guī)的無(wú)菌過濾方法不能將其去除，靶向細(xì)胞壁的抗生素也對(duì)支原體無(wú)效。支原體污染是基礎(chǔ)研究 和工業(yè)生產(chǎn)中一個(gè)很常見的問題，不同實(shí)驗(yàn)室污染情況不盡相同，在一些不重視的實(shí)驗(yàn)室，可能有高達(dá) 90%以上的細(xì)胞受到支原體污染。支原體在光學(xué)顯微鏡下不可見，對(duì)培養(yǎng)基的需求有限，一般不會(huì)引起培 養(yǎng)物混濁，因此細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。支原體污染能消耗營(yíng)養(yǎng)物，促進(jìn)代謝積累，導(dǎo)致 pH 改 變，誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞因子表達(dá)，并改變培養(yǎng)細(xì)胞的代謝、增殖特征及形態(tài)。由于支原體污染能影響幾乎 每一個(gè)細(xì)胞參數(shù)，所以很多研究都強(qiáng)調(diào)常規(guī)檢測(cè)正在培養(yǎng)的細(xì)胞，以確保觀察到的結(jié)果不被支原體污染 所損害。支原體種類繁多，目前已知的污染細(xì)胞的支原體有 20 多種，一般是由試劑和人工操作帶入，95% 的污染事件是由常見的五種支原體引起；由原代細(xì)胞的原始組織帶入也可形成污染，此類污染的支原體 種類分布較為廣泛。
本試劑盒具有以下特點(diǎn)：
①特異性引物是針對(duì)高度保守的支原體 16S rRNA 序列設(shè)計(jì)的，可用于檢測(cè) 非常廣泛的支原體種類，不受真核細(xì)胞或細(xì)菌 DNA 干擾。經(jīng)本試劑盒測(cè)試的支原體菌株涵蓋了所有常見 的支原體污染種類；
②靈敏度極高，最低僅需 10 個(gè)拷貝的支原體基因組即可使檢測(cè)呈陽(yáng)性；
③含陽(yáng)性對(duì) 照，可幫助判斷假陰性現(xiàn)象；
④只需進(jìn)行一次 PCR 反應(yīng)，使用方便。
| 貨號(hào)：iCell-MD01-001 | 規(guī)格：50 個(gè)反應(yīng) |
| 貨號(hào)：iCell-MD01-001 | 規(guī)格：100 個(gè)反應(yīng) |
試劑盒組份
組份 成份 體積（微升）
MD01-20 MD01-50 MD01-100
組份 A（藍(lán)蓋管） Taq 酶，dNTPs，染料 250 625 1250
組份 B（綠蓋管） 上下游引物 50 125 250
組份 C（黃蓋管） 陽(yáng)性對(duì)照樣品 50 125 250
水（白蓋管） 無(wú) DNA 酶超純水 200 500 1000
保存條件：保存于-20℃ , 避免反復(fù)凍融。沒有反復(fù)凍融的情況下，保質(zhì)期一年。
操作步驟：
1、樣品準(zhǔn)備： 取 1 毫升細(xì)胞培養(yǎng)上清（貼壁和懸浮細(xì)胞都可以,最好已培養(yǎng) 48 小時(shí)以上），在 16000g 離心 5 分鐘，小心棄去上清，避免丟失沉淀（沉淀量有可能很少，目視看不到）。將沉淀用無(wú)菌 PBS 重懸， 在 16000g 離心 5 分鐘，同樣小心棄去上清，如此反復(fù)用無(wú)菌 PBS 洗三次。最后將獲得的沉淀用 100 微升 超純水重懸，置于 100℃水浴中孵育5 分鐘，如此獲得的 DNA 可在 4 度保存 1 到 2 個(gè)月。對(duì)于組成成份 較復(fù)雜的組織樣本或拭子，建議使用 DNA 抽提試劑盒提取 DNA。
2 、PCR 反應(yīng)的準(zhǔn)備：
待試劑盒各組份在室溫融化后先瞬時(shí)離心，然后輕彈混勻。按下表在已滅菌的 PCR 管中配制反應(yīng)體
系，每次實(shí)驗(yàn)均需加一個(gè)陰性和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)試反應(yīng)管可以有多個(gè)。配制過程中應(yīng)注意無(wú)菌，戴口 罩，并注意避免操作產(chǎn)生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染，推薦在有風(fēng)壓的設(shè)備如超凈臺(tái)或生物安全柜 中進(jìn)行操作。配制完畢后瞬時(shí)離心以使液體沉至管底。
本試劑盒非常靈敏，操作時(shí)產(chǎn)生的微量氣溶膠即可造成樣品之間的相互污染，因此須小心謹(jǐn)慎，避 免劇烈操作。加液時(shí)槍頭最好貼著管壁，所有管子用完即蓋，對(duì)照樣品和待測(cè)樣品留在最后一步加入，取過樣品的槍頭用完即棄，盡量減少操作時(shí)污染的可能性。
體積（微升） 陰性對(duì)照管 陽(yáng)性對(duì)照管 測(cè)試反應(yīng)管*
組份 A 12.5 12.5 12.5
組份 B 2.5 2.5 2.5
組份 C - 2.5 2.5 / - *
水 10 7.5 5.5 / 8 *
待測(cè)樣品 - - 2
總體積 25 25 25
*組份C 可以提供一個(gè)排除假陰 性的方法：在不確定待測(cè)樣品是否 含有PCR 抑制物的情況下，可單獨(dú) 設(shè)置一管，將一個(gè)或多個(gè)待測(cè)樣品 與組份C 共同反應(yīng)，若無(wú)條帶出現(xiàn)， 則可判斷為PCR 反應(yīng)受到了抑制， 即存在PCR 抑制物，可能產(chǎn)生假陰 性結(jié)果。
3 、PCR 反應(yīng)
降落 PCR 法（Touchdown PCR）：94℃變性 2 分鐘；首循環(huán)：94℃變性 30 秒，68℃退火 30 秒，72℃ 延伸 45 秒；從第二到八個(gè)循環(huán)開始，每循環(huán)退火溫度下降 1℃, 其余不變；從第九個(gè)循環(huán)開始，反應(yīng)條 件固定為：94℃變性 30 秒，60℃退火 30 秒，72℃延伸 45 秒，循環(huán) 32 次；循環(huán)結(jié)束后，在 72℃延伸 7 分鐘，最后保持在 4℃。
4、瓊脂糖凝膠電泳：
按常規(guī)方法準(zhǔn)備好 2%瓊脂糖凝膠，加入 EB 或 Gold-View 等用于顯色。每份反應(yīng)液取 8 微升，無(wú)須 加入上樣緩沖液，直接加入凝膠加樣孔中，另留一孔加入 DNA marker（最好在 400-700bp 區(qū)間有顯示條 帶），120 伏電泳約 30 分鐘。在紫外線下觀察電泳結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照（組份 C）應(yīng)在 643bp 處有一條帶，陰 性對(duì)照無(wú)條帶，支原體陽(yáng)性條帶在 438-470bp 區(qū)間。
1、組份 A 中含有染料，染料的加入不影響 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可直接電泳，節(jié)省時(shí)間。
2、本試劑盒采用降落 PCR 法（退火溫度每循環(huán)降低一度），相比常規(guī) PCR 循環(huán)（退火溫度固定），靈 敏度和特異性均有明顯提高。與支原體親緣關(guān)系較近的一些革蘭氏陽(yáng)性菌在反應(yīng)中的靈敏度較支原體低 1000-10000 倍，使用高濃度的純化基因組可能產(chǎn)生微弱的信號(hào)。這些革蘭氏陽(yáng)性菌一般不會(huì)出現(xiàn)在細(xì)胞 培養(yǎng)物中，且由革蘭氏陽(yáng)性菌引起的陽(yáng)性在細(xì)胞污染檢測(cè)時(shí)是可以接受的，因此本試劑盒可以改用常規(guī) PCR 循環(huán)（退火溫度固定在60℃, 40 個(gè)循環(huán)）。
3、有些細(xì)胞的培養(yǎng)上清可直接進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，也有些細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生抑制 PCR 反應(yīng)的代謝物，因此直接 使用上清可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果，故不建議此法。本試劑盒采用的 PBS 洗滌法可以在大多數(shù)情況下去除 PCR 抑制劑，如果去除不掉的話，則需要使用 DNA 抽提試劑盒提取支原體 DNA。絕大多數(shù) PCR 抑制劑可在提 取 DNA 的過程中去除，極少數(shù) PCR 抑制劑，如黑色素，DNA 抽提試劑盒也不能去除，此時(shí)可以通過加入 高濃度（如 2%）的 BSA（牛血清白蛋白）中和其抑制活性，或者降低樣品上樣量以降低 PCR 抑制劑在反 應(yīng)液中的濃度。
4 、本試劑盒僅供科研使用。
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