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細(xì)胞介紹

人前列腺癌細(xì)胞LNCaP克隆FGC是從一位50歲白人男性(血型B+)的左鎖骨淋巴結(jié)針刺活檢中分離，該患者經(jīng)確診為前列腺癌轉(zhuǎn)移。這株細(xì)胞對(duì)5-α-二氫睪酮(生長調(diào)節(jié)子和酸性磷酸脂酶產(chǎn)物)有響應(yīng)。

細(xì)胞特性

1） 來源：前列腺；左鎖骨淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移灶

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，輕微貼壁（細(xì)胞貼壁能力較弱，需使用特殊培養(yǎng)瓶）

3） 含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用。

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）半貼細(xì)胞和貼壁不牢（懸?。┘?xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱中約2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況，若細(xì)胞密度在60%以下，客戶需收集T25瓶中的懸浮細(xì)胞離心后用完全培養(yǎng)基重懸后打回到原培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，若細(xì)胞生長70%-90%對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳代時(shí)需要收集培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞離心后回收。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

一、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1） 準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；         （iCell-0002）           89%

優(yōu)質(zhì)胎牛血清；                               （iCell-0500）           10%

P/S青霉素-鏈霉素                       （iCell-15140-122）       1%

2）培養(yǎng)注意事項(xiàng)

a. .該細(xì)胞貼壁性不牢，需使用Corning的cellbind細(xì)胞培養(yǎng)瓶,貨號(hào)是3289 。

b. 這株細(xì)胞并不形成一致的單層，而是形成集落。傳代時(shí)如胰酶消化后細(xì)胞形成聚團(tuán)，可以用滴管反復(fù)吹吸打碎。

c. 該細(xì)胞僅僅輕輕地吸附在基底上，不形成匯合，很快使培養(yǎng)基變酸。 生長很慢。 傳代后48小時(shí)內(nèi)不應(yīng)擾動(dòng)。

d. 細(xì)胞封包、寄出時(shí)，多數(shù)細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底分離，懸浮在培養(yǎng)基中。 收到后，在通常培養(yǎng)單層細(xì)胞的條件下培養(yǎng)24到48小時(shí)，以使細(xì)胞再貼壁。 此后可以換上新鮮培養(yǎng)液。 如果需要，培養(yǎng)瓶內(nèi)容物可以收集，300g離心15分鐘，以適量培養(yǎng)液重懸并培養(yǎng)到一個(gè)單獨(dú)的培養(yǎng)瓶中。

E.細(xì)胞復(fù)蘇，換液和傳代時(shí)候注意事項(xiàng)。1.傳代和換液的時(shí)候完全培養(yǎng)基需要預(yù)熱10min左右。否則細(xì)胞容易脫落。2.復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，需要培養(yǎng)瓶加入完培放入培養(yǎng)箱中10-15min孵育，使細(xì)胞更容易貼壁。

3）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

4）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)70%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

該細(xì)胞為懸浮和輕微的貼壁細(xì)胞，傳代可以參考以下方法

1. 收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤洗后細(xì)胞會(huì)脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3） 細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。