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適用范圍：BL21(DE3)，W3110，TG1及相關(guān)菌株

一、背景介紹

本試劑盒是用來(lái)定量分析以大腸桿菌（E.coli）為表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，蛋白藥物中宿主細(xì)胞殘留蛋白。

 大腸桿菌被廣泛用來(lái)作為表達(dá)系統(tǒng)，在破碎菌體提取目標(biāo)蛋白過(guò)程中，很大一部分宿主蛋白與目的蛋白一起釋放，該宿主蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，導(dǎo)致不良的毒性或免疫反應(yīng)而危及產(chǎn)品安全和質(zhì)量，造成潛在的生物污染，生物醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)下游過(guò)程的目的之一就是移除這些潛在危害。

因此，非常有必要將宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留量降低到最低水平，在研發(fā)下游純化的工藝時(shí)，必須具有一種科學(xué)合理的測(cè)定成品或者半成品中HCP濃度的方法，而酶聯(lián)免疫法具有極高靈敏度，因而被FDA,EMA,NMPA及ICH等國(guó)內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)定為HCP檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。                                                                                

二、實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用了固相夾心法的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。先將捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體。檢測(cè)時(shí)在包被抗體的微孔板中先加入待測(cè)抗原孵育，洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體，形成包被抗體-抗原-檢測(cè)抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后去除未參與反應(yīng)的結(jié)合物，最后加入底物TMB顯色。TMB在HRP的氧化作用下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。氧化后的TMB顏色和因子的總含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與濃度擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)樣本OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品中因子濃度。

三、試劑盒優(yōu)勢(shì)

1. 覆蓋度廣：抗體有較強(qiáng)的識(shí)別HCP能力，覆蓋度80%以上，工藝穩(wěn)定。

2. 抗體滴度高：試劑盒中使用的抗體，間接法Elisa檢測(cè)抗血清效價(jià)達(dá)106。

3. 靈敏度高：血清抗體純化采用親和純化，最大限度去除非特異性抗體。

4. 穩(wěn)定性高：生產(chǎn)過(guò)程采用廣譜蛋白穩(wěn)定劑，和微孔板處理工藝，增加標(biāo)準(zhǔn)品及微孔板熱穩(wěn)定性和結(jié)果的可重復(fù)性。

5. 適用性：試劑盒適經(jīng)不同反應(yīng)溫度（20-30度）和不同反應(yīng)時(shí)間（±10分鐘）測(cè)試，檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性較好。

6. 稀釋液優(yōu)化：使用優(yōu)化稀釋液，可降低樣本檢測(cè)過(guò)程中非特異性吸附，本底顯色極低利于觀察待測(cè)樣本濃度。

四、試劑盒組分

五、實(shí)驗(yàn)需要但未提供的耗材及設(shè)備

六、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備

請(qǐng)仔細(xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)在室溫（20-25度，下同）下進(jìn)行。

七、試劑的準(zhǔn)備

1. 試劑盒內(nèi)所有試劑及包被板，請(qǐng)?jiān)谑褂们?0分鐘拿出，使其恢復(fù)室溫。

2. 洗液的稀釋?zhuān)簩?瓶體積為10mL的20×洗液母液，加入950mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請(qǐng)將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。

3. 稀釋液的準(zhǔn)備：將10mL 10×稀釋液母液，加入90mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請(qǐng)將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解，用作標(biāo)準(zhǔn)品，樣品，檢測(cè)抗體的稀釋液。

八、操作步驟

1. 撕開(kāi)包裝袋，取出包被有抗體的酶標(biāo)板，拆下不需要使用的板條，并用封板膜封好，放回鋁箔袋，重新放回4℃保存（板架可重復(fù)使用）。標(biāo)準(zhǔn)品由于運(yùn)輸顛簸可能會(huì)粘在管壁上，使用前輕微甩勻，或在離心機(jī)上離心2秒左右。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)?/span>

配置標(biāo)曲時(shí)提前標(biāo)記8只樣品稀釋管，預(yù)加入一定體積的稀釋液，其中IS0（98μL），S1（495μL），S2至S5（各250μL），S6-S7（各300μL）。

（1）取2μL標(biāo)準(zhǔn)品母液（濃度為500μg/mL）加入到標(biāo)記為IS0的管，輕輕吹打2次并顛倒混勻（后續(xù)操作相同，切勿渦旋等劇烈混勻）。

（2）取5μL濃度為10μg/mL的IS0到S1管，輕輕吹打2次并顛倒混勻。

（3）取250μL濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品S1到S2，之后以2倍梯度稀釋至S5。

（4）取100μL濃度為6.25ng/mL的S5至S6中（4倍稀釋?zhuān)?，輕輕吹打2次并顛倒混勻。

（5）取100μL濃度為1.56ng/mL的S6至S7中（4倍稀釋?zhuān)?，輕輕吹打2次并顛倒混勻。

注：標(biāo)準(zhǔn)曲線有7個(gè)點(diǎn)，分別命名為S1、S2、S3……S7。其中S1即標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)（100ng/mL）。

3. 加樣：取100μL標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本加入微孔板中?？瞻讓?duì)照（Blank Control）加入100μL樣本稀釋液即可。

4. 將酶標(biāo)板用封板膜密封后室溫振蕩孵育1.5小時(shí)。

5. 洗板機(jī)洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗板機(jī)的洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液體，洗板機(jī)洗板5次。

? 洗板完成后，將微孔板倒扣在吸水紙上拍打，充分拍干至無(wú)明顯水膜為止。

或手動(dòng)洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液體，在吸水紙上輕輕拍打至無(wú)明顯液滴。

? 用多道移液槍向每個(gè)微孔中加300μL洗液，靜置20秒，倒去洗液，將微孔板倒扣在吸水紙上輕輕拍打。重復(fù)5次。注：第五次洗板時(shí)，充分拍干至無(wú)明顯水膜為止。

6. 檢測(cè)抗體：取檢測(cè)抗體母液（100×）60μL到6mL稀釋液中稀釋至工作濃度（1×），取100μL加入到各微孔中，將酶標(biāo)板用封板膜密封后室溫振蕩孵育1.5小時(shí)。

7. 洗板：重復(fù)步驟5。

8. 顯色：各微孔板加入100μL TMB溶液，室溫反應(yīng)15分鐘左右。若顏色淺可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，勿超過(guò)30分鐘。

9. 終止：各微孔中加入50μL終止液，終止反應(yīng)。

10. 讀取OD值：在波長(zhǎng)450nm下讀取OD值。

11. 數(shù)據(jù)分析：推薦使用四參數(shù)回歸擬合。

九、注意事項(xiàng)

（一）樣本收集注意事項(xiàng)

1. 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃（少于3個(gè)月）或-80℃（少于6個(gè)月）以保持蛋白活性，避免污染和反復(fù)凍融。如果要在24小時(shí)內(nèi)分析樣本，可以保存在2-8℃。

2. 冷凍樣本使用前請(qǐng)保證充分化凍（請(qǐng)勿加熱融化樣本），使用前用移液器或者Vortex混勻，樣本液中含有沉淀物會(huì)對(duì)ELISA有干擾，可離心去除。

3. 某些化學(xué)裂解液（如SDS，Triton等）可能會(huì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)造成干擾，謹(jǐn)慎使用。

4. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品及樣本都設(shè)置復(fù)孔。向微孔中加入樣本，保證不要有氣泡。

5. 目標(biāo)蛋白純化過(guò)程通常伴隨成分復(fù)雜的緩沖液，建議首次使用不同緩沖液時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收，以排除基質(zhì)干擾效應(yīng)。通常，高鹽、低pH、多糖、有機(jī)溶劑及去污劑會(huì)導(dǎo)致較低回收率。具體做法：將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品S1（100ng/mL）與待測(cè)試溶液基質(zhì)按照1：1體積混合（如50μL含/不含濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品S1加入50μL待測(cè)溶液），計(jì)算時(shí)用加標(biāo)后濃度減去加標(biāo)前本底濃度，再除以理論濃度即為加標(biāo)回收率。

（二）實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

1. 請(qǐng)不要將本試劑盒的試劑與其他試劑盒試劑交叉使用。

2. 實(shí)驗(yàn)操作使用一次性吸頭，避免交叉污染。

3. 加樣：加樣時(shí)要控制時(shí)間和速度，一般加樣時(shí)間控制在10分鐘內(nèi)。如果樣本數(shù)量過(guò)多，可使用多道移液器。

4. 洗滌：洗滌時(shí)微孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上充分拍干，并要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5. 由于底物TMB溶液是光感性的試劑，使用前請(qǐng)勿長(zhǎng)時(shí)間暴露于可見(jiàn)光下。同時(shí)要避免TMB與金屬接觸。

6. 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

7. 本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。

8. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.95。

9. 拍板示意圖:

十、數(shù)據(jù)處理

1. 對(duì)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各自對(duì)應(yīng)的復(fù)孔OD值取平均值。

2. 以標(biāo)準(zhǔn)品的OD作為Y值，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為X值，推薦選擇四參數(shù)logistic（4-PL）曲線擬合。

3. 將樣本OD代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算樣本中待檢樣本的濃度。

4. 以下曲線僅供參考。

附件一、標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)例

十一、試劑盒質(zhì)量控制

1. 靈敏度

最低檢測(cè)限（LOD）：0.195ng/mL   最低定量限（LOQ）：0.39ng/mL

2. 精密度

批內(nèi)差CV%：7.3-13.1   批間差CV%：8.1-11.5

3. 特異性

十二、常見(jiàn)問(wèn)題及分析

若實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示異常，請(qǐng)及時(shí)對(duì)顯色結(jié)果進(jìn)行拍照記錄，并完整保存未使用的板條及試劑，同時(shí)聯(lián)系技術(shù)支持。此外，亦可參考后續(xù)提供的排查信息以確定問(wèn)題根源。