細胞描述
C57BL/6植入c2J囊胚時，毛色嵌合體的得率高；而植入FVB囊胚產(chǎn)生的嵌合體數(shù)量少。ES細胞可以進入FVB/NJ（FVB）和同源突變品系C57BL/6-Tyrc-2J（c2J）這兩個供體宿主囊胚的生殖系。
細胞特性
1） 來源：小鼠，C57BL/6品系，雄性 胚胎內(nèi)細胞團
2） 形態(tài)：球形克隆 貼壁生長
3） 含量：>1x10^6 細胞數(shù)
4） 規(guī)格：1mL凍存管包裝
5） 用途：僅供科研使用
運輸和保存
干冰運輸：1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備
1）準備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (iCell-0001) 81.5%
優(yōu)質(zhì)胎牛血清 （iCell-0500） 15 %
GlutaMAX-1谷氨酰胺 (iCell-0900) 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 (iCell-01000) 1%
P/S青霉素-鏈霉素 （iCell-15140-122） 1%
β-巰基乙醇 (iCell-8211) 1.25 mL
LIF (iCell-50756) 10ng/mL
注意：
1、建議使用CF-1 MEF作為飼養(yǎng)層細胞。
2、在鋪胚胎干細胞前，需對MEF進行處理，具體處理步驟見下文絲裂霉素滅活MEF。
3、該細胞建議凍存干冰發(fā)貨，不適合長時間活細胞運輸，會影響細胞活力。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：完全培養(yǎng)液 60%%，F(xiàn)BS 30%%，DMSO 10%%現(xiàn)用現(xiàn)配。
我?guī)靸龃鏁r，體積為 500 μl，預(yù)期存活率 70%，每支凍存管的細胞復(fù)蘇，3 至4 天后，會形成 30 至 40 個克隆，建議復(fù)蘇至 1 個 T25 培養(yǎng)瓶中。
二：細胞處理
絲裂霉素滅活MEF
待MEF細胞密度達到80%以上，加入含絲裂霉素（15μg/mL）的MEF完全培養(yǎng)液，置于37培養(yǎng)箱中孵育2.5h，2.5h后，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗1-2遍，加入MEF培養(yǎng)基，備用，當天2h后或者第二天可以傳入小鼠胚胎干細胞。
復(fù)蘇：
1.將小鼠胚胎干細胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。
4. 重復(fù)吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 轉(zhuǎn)移至 1 個已經(jīng)鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液。
傳代：
1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定
2. 吸除廢液。
3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液終止消化。
7. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。
8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細胞， 制成單細胞懸液。
9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液，吹打混勻，細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個 T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。
傳代比例：1:4-1:7
凍存：
1.按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。
2. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細胞。
3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4．將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方：
小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液 60%，ES 級 FBS 30%，DMSO 10%
附：小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞分離的簡易方法（差速貼壁法）：
1. 培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細胞，按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液重懸細胞， 吹打混勻，細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞，在一個 10 cm 培養(yǎng)皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞）中。
2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時。
3. 1 小時后，絕大部分 MEF 細胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液，進行后續(xù)實驗。
1.收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
2.收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩(wěn)定細胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據(jù)。
3.由于細胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?，故本公司只保證客戶收到細胞后一周內(nèi)的細胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。
4.所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
5.客戶在細胞培養(yǎng)過程中，有任何技術(shù)問題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話：021-34512991，我們隨時給予解答。
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