細(xì)胞描述
該細(xì)胞系被報道具有生殖能力，源自一個攜帶LacZ報告基因的C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠。這段轉(zhuǎn)基因在pUC19中組裝，包含1.9 kb人54 HS-2片段（兩側(cè)KpnI/PvuII酶切位點），位于標(biāo)記的?-珠蛋白轉(zhuǎn)基因上游。培養(yǎng)時需使用昆明白MEF（SCSP-101R）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。
細(xì)胞特性
1） 來源：小鼠，57BL/6Tac品系 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)
2） 形態(tài)：球形克隆 貼壁生長
3） 含量：>1x10^6 細(xì)胞數(shù)
4） 規(guī)格：1mL凍存管包裝
5） 用途：僅供科研使用
運輸和保存
干冰運輸：1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備
1）準(zhǔn)備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (iCell-0001) 81.5%
優(yōu)質(zhì)胎牛血清 （iCell-0500） 15 %
GlutaMAX-1谷氨酰胺 (iCell-0900) 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 (iCell-01000) 1%
P/S青霉素-鏈霉素 （iCell-15140-122） 1%
β-巰基乙醇 (iCell-8211) 1.25 mL
LIF (iCell-50756) 10ng/mL
注意：
1、建議使用KM- MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。
2、在鋪胚胎干細(xì)胞前，需對MEF進(jìn)行處理，具體處理步驟見下文絲裂霉素滅活MEF。
3、該細(xì)胞建議凍存干冰發(fā)貨，不適合長時間活細(xì)胞運輸，會影響細(xì)胞活力。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：完全培養(yǎng)液 60%%，F(xiàn)BS 30%%，DMSO 10%%現(xiàn)用現(xiàn)配。
我?guī)靸龃鏁r，體積為 500 μl，預(yù)期存活率 70%，每支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇，3 至4 天后，會形成 30 至 40 個克隆，建議復(fù)蘇至 1 個 T25 培養(yǎng)瓶中。
二：細(xì)胞處理
絲裂霉素滅活MEF
待MEF細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，加入含絲裂霉素（15μg/mL）的MEF完全培養(yǎng)液，置于37培養(yǎng)箱中孵育2.5h，2.5h后，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗1-2遍，加入MEF培養(yǎng)基，備用，當(dāng)天2h后或者第二天可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞。
復(fù)蘇：
1.將小鼠胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。
4. 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 轉(zhuǎn)移至 1 個已經(jīng)鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
6. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。
傳代：
1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定
2. 吸除廢液。
3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化。
7. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。
8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細(xì)胞， 制成單細(xì)胞懸液。
9. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個 T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。
傳代比例：1:4-1:7
凍存：
1.按傳代的方法將細(xì)胞消化下來，制成細(xì)胞懸液。
2. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4．將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方：
小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 60%，ES 級 FBS 30%，DMSO 10%
附：小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞分離的簡易方法（差速貼壁法）：
1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞，按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到無 MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞，在一個 10 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞）中。
2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時。
3. 1 小時后，絕大部分 MEF 細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實驗。
1.收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
2.收到細(xì)胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù)。
3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?，故本公司只保證客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細(xì)胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。
4.所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
5.客戶在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，有任何技術(shù)問題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話：021-34512991，我們隨時給予解答。
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