CCK-8檢測(cè)（Cell Counting kit-8）
CCK-8細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)為MTT法的替代方法，是一種基于WST（2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四氮單鈉鹽），廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性的檢測(cè)。
CCK-8（Cell Counting kit-8）試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan），生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，可采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。
技術(shù)應(yīng)用
該方法已被廣泛用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)（1-6天）、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、藥物敏感度實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)等。
實(shí)驗(yàn)流程：
（1）客戶提供細(xì)胞株（凍存株或培養(yǎng)細(xì)胞）及處理用的藥物
（2）進(jìn)行加藥處理及孵育時(shí)間
（3）檢測(cè)吸光度值
（4）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖片
優(yōu)點(diǎn)：
（1）MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫還原酶還原成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來(lái)溶解,而CCK-8產(chǎn)生的formazan都是水溶性的,可以省去后續(xù)的溶解步驟;
（2）CCK-8檢測(cè)靈敏度更高,更加穩(wěn)定;
（3）酚紅和血清對(duì)其測(cè)定無(wú)明顯影響;
（4）不必去上清,不必洗,滌細(xì)胞,更加簡(jiǎn)便;
（5）對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性,加入顯色后,可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板,使檢測(cè)時(shí)間更加靈活,而且不影響細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
在加藥實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)CCK-8測(cè)定的影響：
（1）注意如果藥物具有還原性,會(huì)和CCK-8發(fā)生顯色反應(yīng),增加吸光度。
（2）藥物中的金屬對(duì)CCK-8顯色有影響:當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛、氧化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%,15%, 90%的顯色反應(yīng),使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10mM的話，將會(huì)100%抑制。
解決辦法
首先要確認(rèn)藥物是否有吸收,在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8,測(cè)定450nm的吸光度,如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基(加CCK-8)的吸光度高,則證明藥物有影響,可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基,去掉藥物的影響。
（3）由于培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì),在正式實(shí)驗(yàn)之前,建議使用一個(gè)孔作一下檢測(cè),有必要先確認(rèn)培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)。一般正常的0D值應(yīng)該在0.4以下。
空白對(duì)照
在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8,培養(yǎng)一定的時(shí)間,測(cè)定450nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))時(shí),還應(yīng)考慮藥物的吸收,可在不含細(xì)胞,加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8,培養(yǎng)一定的時(shí)間,測(cè)定450nm的吸光度作為空白對(duì)照。
靈敏度影響
（1）對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度不一樣，懸浮細(xì)胞較貼壁細(xì)胞難染色。
（2）對(duì)于貼壁細(xì)胞,一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過(guò)延長(zhǎng)CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來(lái)解決。
細(xì)胞黏附性
（1）以層粘連蛋白(Ln)包被96孔板,通過(guò)計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)孔板中貼壁細(xì)胞的數(shù)量反映細(xì)胞的黏附性。
（2）細(xì)胞的黏附性越強(qiáng),則單位時(shí)間內(nèi)貼于鋪有Ln板底的細(xì)胞數(shù)量越多，去除尚未貼壁的細(xì)胞后，應(yīng)用CCK-8等方法計(jì)量細(xì)胞數(shù)量便可間接反映不同細(xì)胞或不同處理的細(xì)胞黏附能力的差異。
藥物濃度檢測(cè)
將細(xì)胞培養(yǎng)后按照不同濃度的藥物處理-定時(shí)間后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，根據(jù)吸光度繪制曲線,計(jì)算該藥物抑制細(xì)胞數(shù)量一半時(shí)的濃度(IC50)。
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