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產(chǎn)品描述

本產(chǎn)品為iCell團(tuán)隊(duì)精心優(yōu)化的間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒，可增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞分化的能力。

本產(chǎn)品僅用于科研用途，不可用于診斷、治療、臨床、家庭及其他用途。

產(chǎn)品組成成分及保存

? 注意：1.為保證產(chǎn)品的有效性，請(qǐng)避免反復(fù)凍融。

2. 誘導(dǎo)分化添加劑Ⅱ須現(xiàn)用現(xiàn)配，加入培養(yǎng)基后，須在12小時(shí)內(nèi)用完，否則可能影響實(shí)驗(yàn)效果。

3. 配制好的誘導(dǎo)分化預(yù)混液（不含誘導(dǎo)分化添加劑Ⅱ）保存于2-8℃，有效期為2周。

產(chǎn)品使用說(shuō)明（2D/3D培養(yǎng)）

1. 成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配制

①室溫條件下融化添加劑及血清。（注意：若添加劑或血清中有沉淀物，屬正?，F(xiàn)象，無(wú)須過(guò)濾，避免成分丟失。）

②配制誘導(dǎo)分化預(yù)混液：以下簡(jiǎn)稱預(yù)混液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量，于無(wú)菌操作臺(tái)中配制。建議每次配制50mL，先加細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清，再加誘導(dǎo)分化添加劑。（配制比例見(jiàn)表一）

③配制誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基：根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量，按照1%的比例向預(yù)混液中添加誘導(dǎo)分化添加劑Ⅱ，如每1mL預(yù)混液添加10uL誘導(dǎo)分化添加劑Ⅱ。（注意：誘導(dǎo)分化添加劑Ⅱ須現(xiàn)用現(xiàn)加，配制完成的誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基12h內(nèi)使用完，否則將失效。）

2. 2D成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)步驟

①建議取第3~5代、純度達(dá)90%以上、狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細(xì)胞，將其消化下來(lái)，離心收集，使用含10%FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，均勻鋪于培養(yǎng)瓶/板中。將接種好的細(xì)胞置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（細(xì)胞接種詳情參考表二）

                                                                            表二

②待細(xì)胞匯合度達(dá)80%~100%時(shí)，即可進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

③小心吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，沿孔壁緩慢加入提前配制好的誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（注意：完全培養(yǎng)基加入細(xì)胞前需提前置于37℃預(yù)熱。）

④每2day~3day換用新鮮的誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。換液時(shí)，若細(xì)胞培養(yǎng)上清顏色變?yōu)槌吻宓狞S色，是由于細(xì)胞量較大，培養(yǎng)基消耗較快導(dǎo)致的，請(qǐng)及時(shí)調(diào)整為每日換液。（注意：完全培養(yǎng)基加入前需提前置于37℃預(yù)熱。）

⑤細(xì)胞誘導(dǎo)3周后，即可進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色鑒定。

3. 2D成軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色分析

①細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)束后，小心吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，1×PBS潤(rùn)洗1~2次，室溫固定30 min。（細(xì)胞固定液為4%中性甲醛溶液等，體積參考表二）

②吸棄細(xì)胞固定液，1×PBS潤(rùn)洗2次。沿孔壁緩慢加入甲苯胺藍(lán)染色液，染液體積請(qǐng)參考表二，室溫染色30min。（注意：染色液底部可能會(huì)有沉淀，吸取時(shí)盡量不要觸及底部。若染色后有沉淀，1×PBS洗去即可。）

③吸出染色液，1×PBS潤(rùn)洗，去掉浮色。顯微鏡下觀察細(xì)胞染色效果，背景呈淡藍(lán)色，成軟骨細(xì)胞呈紫紅色。（注意：染色液可重復(fù)使用，建議收集。）

4. 3D成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)步驟

①建議取第3~5代、純度達(dá)90%以上、狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細(xì)胞，將其消化下來(lái)，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度，按照每管3~4×105cell將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，20℃，250×g離心4min。

②棄上清，每管加入0.5mL預(yù)混液，重懸細(xì)胞沉淀。20℃，150×g離心5min。

③棄上清，每管加入0.5mL成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，20℃，150×g離心5min。

④將離心管樹(shù)立放置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擰松離心管蓋以便于氣體交換。（注意：此步驟無(wú)需重懸細(xì)胞，且24h內(nèi)不可晃動(dòng)離心管。）

⑤約24h~48h后，細(xì)胞出現(xiàn)聚團(tuán)現(xiàn)象，輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮于培養(yǎng)液中。

⑥每2~3day換用新鮮的誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，持續(xù)誘導(dǎo)三周后，即可將培養(yǎng)液更換為固定液（4%中性甲醛），將軟骨球固定，后續(xù)進(jìn)行切片染色鑒定實(shí)驗(yàn)。

質(zhì)量控制

ü 無(wú)菌檢測(cè)（細(xì)菌、真菌和支原體檢測(cè)）

ü pH測(cè)試

ü 滲透壓檢測(cè)

ü 內(nèi)毒素

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