貨號(hào)：iCell-h299（STR鑒定）
細(xì)胞名稱(chēng)：H1
細(xì)胞描述：人胚胎干細(xì)胞，曾用名WA01
形 態(tài)：球形克隆，貼壁生長(zhǎng)
來(lái)源性別：男性
組織：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)
凍存日期/代數(shù)：詳見(jiàn) 凍存管/培養(yǎng)瓶 標(biāo)識(shí)
建議復(fù)蘇培養(yǎng)體系：1 個(gè) T25 培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿
細(xì)胞狀態(tài)：良好
支原體檢測(cè)結(jié)果：陰性
細(xì)胞用途：僅供科研使用。
STR鑒定結(jié)果：
Amelogenim：X Y
D5S818：9，11
D13S317：8,11
D7S820：8，12
D16S539：9，13
vWA：15，17
THO1：9.3，13
TPOX：8，18
CSF1PO：12，13
H1細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞
1.試劑和材料
H1細(xì)胞完全培養(yǎng)基試劑盒
成分 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 儲(chǔ)存條件 |
H1細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 | 500mL | 1瓶 | 2-8℃ |
H1細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑 | 20mL | 1支 | -20℃ |
所需的其它試劑和材料
產(chǎn)品 | 規(guī)格 | 貨號(hào) | 品牌 | |
Y27632 | 1mg | H1Med-iCell-CA005 | iCell | |
Matrigel | 5mL | H1Med-iCell-CA004 | iCell | |
H1細(xì)胞消化液 | 500mL | H1Med-iCell-CA003 | iCell | |
ES細(xì)胞專(zhuān)用凍存液 | 100mL | iCell-0700-T | iCell | |
另需細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶/板，15mL離心管和移液管等細(xì)胞培養(yǎng)耗材 | ||||
2.培養(yǎng)流程
2.1試劑的制備
2.1.1 完全培養(yǎng)基制備
2.1.1在室溫（15-25℃）或冰箱內(nèi)（2-8℃）過(guò)夜解凍細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑，可在無(wú)菌條件下將添加劑分裝為適量的工作等份，并在-20℃下凍存。冷凍的分量須在3個(gè)月內(nèi)用完。解凍后的分量應(yīng)該一天內(nèi)制備成完全培養(yǎng)基。請(qǐng)勿在解凍后再次冷凍。
2.1.2.在無(wú)菌條件下將20mL的添加劑全部解凍后加入到500mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，充分混勻。完全培養(yǎng)基在（2-8℃）下儲(chǔ)存時(shí)刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多2-3周，或在-20℃下冷凍時(shí)刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多3個(gè)月。在室溫（15-25℃）或冰箱內(nèi)（2-8℃）過(guò)夜解凍冷凍的培養(yǎng)基，不要長(zhǎng)時(shí)間放在37℃水浴內(nèi)加熱培養(yǎng)基。
如果在無(wú)菌條件下制備，細(xì)胞完全培養(yǎng)基可直接使用。
2.1.2 Matrigel工作液的配制與包被
鑒于基質(zhì)膠的操作環(huán)境要求比較嚴(yán)格，為保證您的實(shí)驗(yàn)順利，特此對(duì)以下幾個(gè)方面進(jìn)行溫馨提示：
1. 收貨時(shí)，首先確認(rèn)還有干冰，Matrigel成固態(tài)，液面水平，如有異常請(qǐng)及時(shí)拍照取證并聯(lián)系我們。
2. 整個(gè)Matrigel只能分裝一次，在分裝前，要先放4℃冰箱（最好先把Matrigel插在冰上，然后放入4℃冰箱）過(guò)夜，且分裝用的槍頭、EP管等都要提前-20℃預(yù)冷（基質(zhì)膠在10℃以上會(huì)發(fā)成膠凝固導(dǎo)致基質(zhì)膠報(bào)廢），整個(gè)分裝過(guò)程都需在冰上進(jìn)行，且以后每次試驗(yàn)時(shí)拿出本次用量所需的基質(zhì)膠。
3. 實(shí)驗(yàn)人員手心不要接觸基質(zhì)膠，如：要手持裝有Matrigel的EP管的上方，防止體溫使基質(zhì)膠成膠凝固。
4. Matrigel的稀釋比例建議為100倍稀釋。
本庫(kù)建議的配制Matrigel工作液方法：
1. 稀釋前將Matrigel放入4℃冰箱過(guò)夜融化。
2. 將適量體積的稀釋液（DMEM/F12或PBS）置4℃冰箱預(yù)冷。
3. 將融化的Matrigel與稀釋液從冰箱中取出并打開(kāi)蓋子，用移液管吹吸稀釋液幾次以冷卻移液管，并吸取少量稀釋液加入Matrigel管中混勻，將Matrigel轉(zhuǎn)移到稀釋液中，并吹打混勻。（因?yàn)镸atrigel遇15℃以上溫度就會(huì)成凝膠粘在原裝玻璃壁和移液管壁上，故Matrigel從冰箱拿出來(lái)以后盡快打開(kāi)蓋子并轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的稀釋液中，吸取Matrigel的移液管一定要冷卻）。
4. 立即用稀釋后的Matrigel包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿。對(duì)于6孔板，每個(gè)孔使用1mL稀釋后的Matrigel，對(duì)于6cm的培養(yǎng)皿，每個(gè)孔使用2mL稀釋后的Matrigel，晃動(dòng)培養(yǎng)板使Matrigel溶液均勻的分布在表面上。
5. 使用前，包被的培養(yǎng)板應(yīng)放在培養(yǎng)箱（37℃）下至少2-3h以上，或者提前一天。請(qǐng)勿讓培養(yǎng)板脫水。在培養(yǎng)板可供使用之前，請(qǐng)勿移除Matrigel溶液。
如果不立即使用，培養(yǎng)板必須密封，以防止脫水。包被后的培養(yǎng)板可在2-8℃下最多儲(chǔ)存7天。
如果Matrigel溶液并未完全覆蓋表面，則無(wú)法實(shí)驗(yàn)最佳的細(xì)胞培養(yǎng)，因此，不建議使用含有溶液已蒸發(fā)區(qū)域的培養(yǎng)板。
如果已將培養(yǎng)板在2-8℃下儲(chǔ)存，則在移除Matrigel溶液之前，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱（37℃）下放置30min。
2.1.3 Y27632的配制
Y27632粉末溶解在PBS中，配制成濃度未10mM的儲(chǔ)存液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。分裝后冷凍于-20℃。
Y27632提高復(fù)蘇和傳代后的克隆形成率，所以只在復(fù)蘇和傳代步驟添加（1:1000，即終濃度為10μM），換液時(shí)不添加。
2.2.復(fù)蘇
在開(kāi)始復(fù)蘇前，將所有試管、預(yù)熱后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿準(zhǔn)備好，已確保盡快完成復(fù)蘇過(guò)程。
1. 將凍存管從液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解凍，輕柔持續(xù)地?fù)u動(dòng)凍存管，直到只剩下一個(gè)小冷凍團(tuán)。從水浴槽取出凍存管，70%乙醇擦拭進(jìn)行消毒。
2. 使用移液管將凍存管中含有H1細(xì)胞的凍存液輕輕轉(zhuǎn)移至一個(gè)含有5-6mL已經(jīng)預(yù)熱的完全培養(yǎng)基的15mL離心管中，過(guò)程必須輕柔防止吹散細(xì)胞團(tuán)。
3. 室溫300g離心5min。
4. 吸出培養(yǎng)基，確保細(xì)胞團(tuán)完整。
5. 然后緩慢加入1mL完全培養(yǎng)基，用手指輕彈離心管底部，使細(xì)胞團(tuán)脫離底部并分散。
6. 輕輕的將此1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至已包被的培養(yǎng)皿/板/瓶，根據(jù)最終培養(yǎng)細(xì)胞的液體體積，加入ROCK inhibitor Y27632，終濃度為10μM。
7. 將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基（換液不需要再添加Y27632，但培養(yǎng)基需提前預(yù)熱）。
2.3.傳代
當(dāng)集落變得較大、中心變得密集、明亮（對(duì)比邊緣），相鄰的集落開(kāi)始融合時(shí)，此時(shí)可進(jìn)行傳代。
1. 傳代前，準(zhǔn)備 37 ℃預(yù)熱好的無(wú)鈣鎂 PBS 溶液及消化液，完全培養(yǎng)基。
2. 吸走上清，并加入 37℃預(yù)熱好的 PBS 溶液清洗1次。
3. 加入適量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃預(yù)熱好的消化液。
4. 37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開(kāi)始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團(tuán)脫落。
5. 加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化。
6. 移入離心管，300g離心5min。
7. 離心后重懸（重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步）。
8. 傳代比例為 1：6—1：8，根據(jù)最終培養(yǎng)細(xì)胞的液體體積，加入ROCK inhibitor Y27632，終濃度為10μM。
9. 將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基（換液不需要再添加Y27632，但培養(yǎng)基需提前預(yù)熱）。
2.4.凍存
當(dāng)集落變得較大、中心變得密集、明亮（對(duì)比邊緣），相鄰的集落開(kāi)始融合時(shí)，此時(shí)可進(jìn)行傳代。
1. 傳代前，準(zhǔn)備 37 ℃預(yù)熱好的無(wú)鈣鎂 PBS 溶液及消化液，完全培養(yǎng)基。
2. 吸走上清，并加入 37℃預(yù)熱好的 PBS 溶液清洗1次。
3. 加入適量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃預(yù)熱好的消化液。
4. 37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開(kāi)始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團(tuán)脫落。
5. 加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化。
6. 移入離心管，300g離心5min。
7. 離心后重懸（重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步）。
8. 使用預(yù)冷的凍存液輕輕的重懸細(xì)胞團(tuán)，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管，凍存按 6 孔板每孔凍 1 支，6cm 皿凍 2-4 支，10cm 皿凍 6-12 支。
H1人胚胎干細(xì)胞說(shuō)明書(shū)及相關(guān)試劑：
1.收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。
2.收到細(xì)胞先不開(kāi)瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過(guò)程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷(xiāo)售依據(jù)。
3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀时竟局槐ＷC客戶(hù)收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶(hù)需要售后時(shí)需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶(hù)提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問(wèn)題后客服人員溝通的時(shí)間證明，期間間隔時(shí)間不能大于7天。
4.所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
5.客戶(hù)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，有任何技術(shù)問(wèn)題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話(huà)：021-34512991，我們隨時(shí)給予解答。
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