適用范圍：BL21，K12，JM109，MC1061，DH5α，TOP10及相關(guān)菌株
一、背景介紹
本試劑盒是用來定量分析以大腸桿菌（E.coli）為表達(dá)系統(tǒng)時，蛋白藥物中宿主細(xì)胞殘留蛋白。
大腸桿菌被廣泛用來作為表達(dá)系統(tǒng)，在破碎菌體提取目標(biāo)蛋白過程中，很大一部分宿主蛋白與目的蛋白一起釋放，該宿主蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，導(dǎo)致不良的毒性或免疫反應(yīng)而危及產(chǎn)品安全和質(zhì)量，造成潛在的生物污染，生物醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)下游過程的目的之一就是移除這些潛在危害。
因此，非常有必要將宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留量降低到最低水平，在研發(fā)下游純化的工藝時，必須具有一種科學(xué)合理的測定成品或者半成品中HCP濃度的方法，而酶聯(lián)免疫法具有極高靈敏度，因而被FDA,EMA,NMPA及ICH等國內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)定為HCP檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用了固相夾心法的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。先將捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體。檢測時在包被抗體的微孔板中先加入待測抗原孵育，洗滌后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體，形成包被抗體-抗原-檢測抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后去除未參與反應(yīng)的結(jié)合物，最后加入底物TMB顯色。TMB在HRP的氧化作用下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。氧化后的TMB顏色和因子的總含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與濃度擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過樣本OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品中因子濃度。
三、試劑盒優(yōu)勢
1. 覆蓋度廣：抗體有較強(qiáng)的識別HCP能力，覆蓋度80%以上，工藝穩(wěn)定。
2. 抗體滴度高：試劑盒中使用的抗體，間接法Elisa檢測抗血清效價達(dá)106。
3. 靈敏度高：血清抗體純化采用親和純化，最大限度去除非特異性抗體。
4. 穩(wěn)定性高：生產(chǎn)過程采用廣譜蛋白穩(wěn)定劑，和微孔板處理工藝，增加標(biāo)準(zhǔn)品及微孔板熱穩(wěn)定性和結(jié)果的可重復(fù)性。
5. 適用性：試劑盒適經(jīng)不同反應(yīng)溫度（20-30度）和不同反應(yīng)時間（±10分鐘）測試，檢測結(jié)果重現(xiàn)性較好。
6. 稀釋液優(yōu)化：使用優(yōu)化稀釋液，可降低樣本檢測過程中非特異性吸附，本底顯色極低利于觀察待測樣本濃度。
四、試劑盒組分
名稱 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 保存 | |
1 | 已包被平底微孔板 | 96孔 | 1板（可拆卸） | 2-8℃密封冷藏 |
2 | 標(biāo)準(zhǔn)品母液（500μg/mL） | 50μL | 1管 | 2-8℃冷藏 |
3 | 檢測抗體母液（100×） | 150μL | 1管 | 2-8℃冷藏 |
4 | TMB | 10mL | 1瓶 | 2-8℃避光冷藏 |
5 | 終止液 | 10mL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
6 | 洗液（20×） | 10mL | 5瓶 | 2-8℃冷藏 |
稀釋液（10×） | 10mL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 | |
8 | 封板膜 | 4張 | ||
使用說明書 | 1份 |
五、實(shí)驗(yàn)需要但未提供的耗材及設(shè)備
1. | 移液器：10μL-1000μL | 6. | 酶標(biāo)儀 |
2. | 多道移液器 | 7. | 高速離心機(jī) |
3. | 滅菌的去離子水或超純水1L | 8. | 迷你離心機(jī) |
4. | 滅菌EP管 | 9. | 洗板機(jī)或者洗瓶 |
5. | 吸水紙 | 10. | 數(shù)據(jù)分析及繪圖軟件 |
六、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備
請仔細(xì)閱讀試劑盒說明書，反應(yīng)在室溫（20-25度，下同）下進(jìn)行。
七、試劑的準(zhǔn)備
1. 試劑盒內(nèi)所有試劑及包被板，請?jiān)谑褂们?0分鐘拿出，使其恢復(fù)室溫。
2. 洗液的稀釋：將5瓶體積為10mL的20×洗液母液，加入950mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。
3. 稀釋液的準(zhǔn)備：將10mL 10×稀釋液母液，加入90mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解，用作標(biāo)準(zhǔn)品，樣品，檢測抗體的稀釋液。
八、操作步驟
1. 撕開包裝袋，取出包被有抗體的酶標(biāo)板，拆下不需要使用的板條，并用封板膜封好，放回鋁箔袋，重新放回4℃保存（板架可重復(fù)使用）。標(biāo)準(zhǔn)品由于運(yùn)輸顛簸可能會粘在管壁上，使用前輕微甩勻，或在離心機(jī)上離心2秒左右。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：
配置標(biāo)曲時提前標(biāo)記8只樣品稀釋管，預(yù)加入一定體積的稀釋液，其中IS0（98μL），S1（495μL），S2至S7（各250μL）。
（1）取2μL標(biāo)準(zhǔn)品母液（濃度為500μg/mL）加入到標(biāo)記為IS0的管，輕輕吹打2次并顛倒混勻（后續(xù)操作相同，切勿渦旋等劇烈混勻）。
（2）取5μL濃度為10μg/mL的IS0到S1管，輕輕吹打2次并顛倒混勻。
（3）取250μL濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品S1到S2，之后以2倍梯度稀釋至S7。
注：標(biāo)準(zhǔn)曲線有7個點(diǎn)，分別命名為S1、S2、S3……S7。其中S1即標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)（100ng/mL）
3. 加樣：取100μL標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣本加入微孔板中?？瞻讓φ眨˙lank Control）加入100μL樣本稀釋液即可。
4. 將酶標(biāo)板用封板膜密封后室溫振蕩孵育1.5小時。
5. 洗板機(jī)洗板：
? 取出稀釋好的洗液放置于洗板機(jī)的洗瓶中備用。
? 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液體，洗板機(jī)洗板5次。
? 洗板完成后，將微孔板倒扣在吸水紙上拍打，充分拍干至無明顯水膜為止。
或手動洗板：
? 取出稀釋好的洗液放置于洗瓶中備用。
? 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液體，在吸水紙上輕輕拍打至無明顯液滴。
? 用多道移液槍向每個微孔中加300μL洗液，靜置20秒，倒去洗液，將微孔板倒扣在吸水紙上輕輕拍打。重復(fù)5次。注：第五次洗板時，充分拍干至無明顯水膜為止。
6. 檢測抗體：取檢測抗體母液（100×）100μL到9.9mL稀釋液中稀釋至工作濃度（1×），取100μL加入到各微孔中，將酶標(biāo)板用封板膜密封后室溫振蕩孵育1.5小時。
7. 洗板：重復(fù)步驟5。
8. 顯色：各微孔板加入100μL TMB溶液，室溫反應(yīng)15分鐘左右。若顏色淺可適當(dāng)延長反應(yīng)時間，勿超過30分鐘。
9. 終止：各微孔中加入50μL終止液，終止反應(yīng)。
10. 讀取OD值：在波長450nm下讀取OD值。
11. 數(shù)據(jù)分析：推薦使用四參數(shù)回歸擬合。
九、注意事項(xiàng)
（一）樣本收集注意事項(xiàng)
1. 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃（少于3個月）或-80℃（少于6個月）以保持蛋白活性，避免污染和反復(fù)凍融。如果要在24小時內(nèi)分析樣本，可以保存在2-8℃。
2. 冷凍樣本使用前請保證充分化凍（請勿加熱融化樣本），使用前用移液器或者Vortex混勻，樣本液中含有沉淀物會對ELISA有干擾，可離心去除。
3. 某些化學(xué)裂解液（如SDS，Triton等）可能會對本實(shí)驗(yàn)造成干擾，謹(jǐn)慎使用。
4. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品及樣本都設(shè)置復(fù)孔。向微孔中加入樣本，保證不要有氣泡。
5. 目標(biāo)蛋白純化過程通常伴隨成分復(fù)雜的緩沖液，建議首次使用不同緩沖液時進(jìn)行加標(biāo)回收，以排除基質(zhì)干擾效應(yīng)。通常，高鹽、低pH、多糖、有機(jī)溶劑及去污劑會導(dǎo)致較低回收率。
具體做法是，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品S1（100ng/mL）與待測試溶液基質(zhì)按照1：1體積混合（如50μL含/不含濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品S1加入50μL待測溶液），計(jì)算時用加標(biāo)后濃度減去加標(biāo)前本底濃度，再除以理論濃度即為加標(biāo)回收率。
（二）實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)
1. 請不要將本試劑盒的試劑與其他試劑盒試劑交叉使用。
2. 實(shí)驗(yàn)操作使用一次性吸頭，避免交叉污染。
3. 加樣：加樣時要控制時間和速度，一般加樣時間控制在10分鐘內(nèi)。如果樣本數(shù)量過多，可使用多道移液器。
4. 洗滌：洗滌時微孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上充分拍干，并要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5. 由于底物TMB溶液是光感性的試劑，使用前請勿長時間暴露于可見光下。同時要避免TMB與金屬接觸。
6. 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。
7. 本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應(yīng)避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。
8. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.95。
9. 拍板示意圖:
十、數(shù)據(jù)處理
1. 對樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各自對應(yīng)的復(fù)孔OD值取平均值。
2. 以標(biāo)準(zhǔn)品的OD作為Y值，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為X值，推薦選擇四參數(shù)logistic（4-PL）曲線擬合。
3. 將樣本OD代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算樣本中待檢樣本的濃度。
4. 以下曲線僅供參考。
十一、試劑盒質(zhì)量控制
1. 靈敏度:
最低檢測限（LOD）：0.39ng/mL 最低定量限（LOQ）：1.56ng/mL
2. 精密度
批內(nèi)差CV%：3-8 批間差CV%：4-9
3. 特異性
樣品 | 濃度 |
HEK293 HCP | Not Detectable |
CHO HCP | Not Detectable |
畢赤酵母HCP | Not Detectable |
漢遜酵母HCP | Not Detectable |
釀酒酵母HCP | Not Detectable |
十二、常見問題及分析
若實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示異常，請及時對顯色結(jié)果進(jìn)行拍照記錄，并完整保存未使用的板條及試劑，同時聯(lián)系技術(shù)支持。此外，亦可參考后續(xù)提供的排查信息以確定問題根源。
問題描述 | 可能原因 | 相應(yīng)對策 |
標(biāo)準(zhǔn)曲線 梯度差 | 稀釋錯誤 | 按照相應(yīng)比例稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線 |
吸液或加液不準(zhǔn) | 檢查移液器及吸頭 | |
酶標(biāo)板洗滌不完全 | 保證洗板次數(shù)及每孔的洗液用量 | |
顯色很弱或無色 | 溫育時間太短 | 保證足夠的溫育時間 |
實(shí)驗(yàn)溫度不正確 | 使用推薦的溫育溫度 | |
試劑體積不夠或漏加 | 檢查吸液及加液過程,保證所有試劑按順序足量添加 | |
顯色液沒有恢復(fù)室溫 | 顯色前將TMB放置室溫半小時以上 | |
OD值讀數(shù)低 | 酶標(biāo)儀設(shè)置不正確 | 在酶標(biāo)儀上檢查波長和濾光片裝置 |
讀數(shù)前應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀進(jìn)行預(yù)熱 | ||
變異系數(shù)(CV值）大 | 加液不正確 | 檢查加液情況 |
酶標(biāo)板底部有污染 | 檢查酶標(biāo)板底部是否有殘留的液體和手印 | |
板孔內(nèi)有異物或氣泡 | 加樣前確認(rèn)板孔內(nèi)無異物，加樣后確認(rèn)無氣泡 | |
溫育過程中未封板或封板不完全 | 用封板膜封板 | |
背景值高 | 酶標(biāo)板洗滌不完全 | 按說明書推薦的方法進(jìn)行洗板 |
如果用自動洗板機(jī),請檢查所有的加液口和排廢液口是否有堵塞 | ||
如果是手洗板，可適當(dāng)增加洗板次數(shù) | ||
洗滌不充分漏洗都會導(dǎo)致高背景 | ||
溫育時間、溫度不正確 | 按照說明書嚴(yán)格要求操作 | |
耗材污染 | 使用的管子、槍頭等耗材不干凈 | |
洗液有污染 | 配制新鮮洗液 | |
顯色液被污染 | 顯色溶液自身是沒有顏色的，確保底物在使用之前沒有被金屬離子或氧化試劑污染，而且避光保存 | |
靈敏度低 | 試劑盒保存不當(dāng) | 按說明書要求保存相關(guān)試劑 |
應(yīng)用：定量檢測蛋白純化過程及終產(chǎn)物中宿主細(xì)胞蛋白殘留
用途：本試劑盒僅供科研和生產(chǎn)使用，不得用于臨床及診斷！
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